Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng các thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ (sau đây gọi tắt là OP) gồm 5 loại thuốc trừ sâu chính: dimethoate, chlorfenvinphos, chlorpyrifos, methidathion và phosmet trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC). Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,2 đến1 mg/kg.

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp So sánh các kỹ thuật làm sạch trong các phương pháp phân tích chọn lọc dư lượng các thuốc trừ sâu OP trong nhuyễn thể ' đăng trong Journal of AOAC international phần 79, số 1, trang 123-131, năm 1996.

Thuốc trừ sâu OP trong mẫu thủy sản được chiết tách ra bằng hỗn hợp axetonitril-axeton. Dịch chiết được làm sạch trên cột silicagel, sau đó được chiết tách làm 2 phân đoạn. Hàm lượng các thuốc trừ sâu OP trong các phân đoạn chiết được xác định trên hệ thống GC với 2 đầu dò: đầu dò bắt giữ điện tử (sau đây gọi tắt là ECD) và đầu dò ion hoá nhiệt phát hiện nitơ-phospho (sau đây gọi tắt là NPD).

4.1 Thiết bị và dụng cụ

4.1.1 Máy sắc ký khí với đầu dò ECD và NPD.

4.1.2 Cột sắc ký thủy tinh (có van khoá), kích thước L x ID là 150 x 5mm và 50 x 20mm.

 4.1.3 Cột mao quản (cho máy GC): loại HP Ultra 2, kích thước L x ID = 25 m x 0,2 mm, độ dày lớp pha tĩnh là 0,33 mm hoặc tương đương. 4.1.4 Máy cô quay chân không.

4.1.5 Máy nghiền đồng thể.

4.1.6 Máy trộn cao tốc.

4.1.7 Tủ sấy.

 4.1.8 Lò nung.

 4.1.9 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. 4.1.10 Các dụng cụ thuỷ tinh, bình định mức.

4.2 Hoá chất

Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm:

4.2.1 Hexan loại dùng cho GC.

4.2.2 Etyl axetat loại dùng cho HPLC.

4.2.3 Sunfat natri dạng hạt, được làm khô bằng sấy qua đêm ở nhiệt độ 350⁰ C và giữ trong chai thuỷ tinh.

4.2.4 Axeton loại dùng cho GC.

4.2.5 Axetonitril loại dùng cho GC 4.2.6 Khí mang: heli loại dùng cho GC. 4.2.7 Bông thuỷ tinh (SUPELCO, 2-0411).

4.2.8 Silicagel cỡ hạt 60 mesh: silica-60 (Merck, Darmstadt, Germany).

4.2.9 Silicagel đã được hoạt hoá: cân một lượng silicagel (4.2.8), rửa sạch bằng điclometan rồi cho vào trong chén sứ và để trong tủ sấy ở nhiệt độ 120 ⁰C trong vòng 12 giờ. Sau đó, dùng giấy thiếc bọc kín miệng chén sứ rồi để lại vào tủ sấy ở nhiệt độ 120 ⁰C trước khi sử dụng.

4.2.10 Xelit

4.2.11 Các chất chuẩn thuốc trừ sâu OP (Promochem, Wesel, Germany): dimethoate, chlorfenvinphos (đồng phân E+Z), chlorpyrifos, methidathion và phosmet.

4.3 Dung dịch thử và dung dịch chuẩn

4.3.1 Dung dịch rửa giải: hỗn hợp gồm dung dịch axetonitril và axeton theo tỷ lệ về thể tích là 9:1 được pha trước khi sử dụng.

4.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn thuốc trừ sâu OP trong axeton từ các chất chuẩn tinh khiết (lớn hơn 99%). Tuỳ theo nồng độ thuốc trừ sâu có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng axeton thích hợp. Chú thích: các chuẩn phải được bảo quản ở nhiệt độ - 20⁰C.

4.3.3 Chuẩn thu hồi: pha các chuẩn của các OP trong dung môi axeton để có hàm lượng trong khoảng 0,005 - 50 mg/ml.

4.3.4 Dung dịch chuẩn trung gian: pha loãng các chuẩn ban đầu (4.3.2) trong axeton được các chuẩn trung gian.

4.3.5 Dung dịch chuẩn công tác: các chuẩn công tác được chuẩn bị từ các chuẩn trung gian (4.3.4) được pha loãng trong hexan (4.2.1) để bơm vào GC.

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Cân chính xác 5 g mẫu (ký hiệu m) đã được nghiền bằng máy nghiền đồng thể (4.1.5) rồi cho vào cốc thuỷ tinh có mỏ. Thêm 1 g xelit (4.2.10), 30 g sunfat natri khan (4.2.3) rồi nghiền đều. Tiếp tục thêm vào 150 ml hỗn hợp dung dịch axetonitril-axeton theo tỷ lệ về thể tích là 9:1 (4.3.1) rồi trộn hỗn hợp trong 3 phút trong máy trộn cao tốc (4.1.6) để chiết lấy các thuốc trừ sâu từ mẫu. Sau đó, lọc dung dịch bằng giấy lọc.

5.1.2 Sản phẩm chiết được cô đặc trên máy cô quay đến khoảng 5 ml, sau đó cô tiếp cho đến khô trên máy cô quay (4.1.4) trong chế độ chân không ở nhiệt độ 40^oC. Thêm vào dịch thu được 1ml hexan (4.2.1) rồi làm sạch dịch chiết theo Ðiều 5.4.

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có chứa thuốc trừ sâu gốc OP. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.

5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

Thêm 1ml dung dịch chuẩn có hàm lượng từ 0,005 đến 50mg/ml vào 5 g mẫu trắng, trộn đều mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.5). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1.

5.4 Làm sạch dịch chiết

5.4.1 Chuẩn bị cột Gồm: bông thuỷ tinh (4.2.7), 1,3 g silicagel đã được hoạt hoá (4.2.9), 1 g sunfat natri khan (4.2.3). Trước khi tiến hành phân tích, cho vào cột 5 ml etyl axetat (4.2.2) và sau đó là 5 ml hexan (4.2.1).

5.4.2 Làm sạch dịch chiết

5.4.2.1 Chuyển dịch thu được tại các Ðiều 5.1.2, Ðiều 5.2 và Ðiều 5.3 vào các cột sắc ký đã được chuẩn bị (5.4.1).

5.4.2.2 Rửa dung dịch trong cột với 5 ml hexan, sau đó với 2 ml hỗn hợp hexan-etyl axetat theo tỷ lệ về thể tích là 95:5. Tiếp theo, rửa giải với 8 ml hỗn hợp hexan-etyl axetat theo tỷ lệ về thể tích là 50:50 rồi tách lấy phân đoạn 1. Sau đó, tiếp tục rửa giải với 5 ml etyl axetat rồi tách lấy phân đoạn 2. Tốc độ rửa giải phải luôn điều chỉnh đạt 10 giọt/phút.

5.4.2.3 Thu các phân đoạn chiết vào các bình thuỷ tinh đáy tròn của máy cô quay chân không (4.1.4). Tiến hành cô trên máy cô quay cho đến khô. Sau đó, thêm chính xác 1 ml hexan vào từng bình, lắc cho tan đều rồi hút để bơm vào máy GC theo Ðiều 5.5.

5.5 Tiến hành phân tích trên GC

 5.5.1 Ðiều kiện phân tích a. Máy sắc ký khí sử dụng đầu dò ECD và NPD, chọn chế độ bơm tự động, mỗi lần một lượng 2ml theo chế độ tiêm không chia.

b. Chế độ nhiệt của hệ thống GC:

- Nhiệt độ của buồng tiêm: 270⁰C

- Nhiệt độ đầu dò ECD: 300 ⁰C, tốc độ dòng N₂: 60ml/phút

- Nhiệt độ đầu dò NPD: 270⁰ C, tốc độ dòng He: 30ml/phút, H₂: 3ml/phút, không khí: 100ml/phút.

- Chương trình nhiệt độ cột (mô tả chi tiết trong Biểu đồ 1): Duy trì ở 90 ⁰C trong 1 phút; tăng 30⁰C/phút, lên tới 180⁰C; tăng 4⁰C/phút, lên tới 270⁰C và duy trì ở 270⁰C trong 20 phút  

c. Cột sắc ký: Cột mao quản HP Ultra 2, chất nhồi cột chứa 5% metylsilicol, chiều dài 25 m, đường kính trong 0,2 mm, độ dày lớp pha tĩnh 0,33 mm.

d. Khí: Khí mang: heli, tốc độ 0,5ml/phút.

 

5.5.2 Tiến hành phân tích

5.5.2.1 Tiêm các dung dịch chuẩn công tác (4.3.5) vào máy GC theo thứ tự từ nồng độ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại thuốc trừ sâu theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax+b).

5.5.2.2 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi đã được làm sạch (5.4.2.3) vào hệ thống GC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.

5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn (CV_S) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%.

5.6.2 Ðộ thu hồi (R)

Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã được bổ sung một lượng dung dịch chuẩn để tính đuợc hàm lượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 70 đến 110% (tuỳ theo hàm lượng OP có trong mẫu).

4.6.3 Ðường chuẩn của mỗi cấu tử phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R²) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

6 Tính kết quả

Hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được tại Ðiều 5.5.2.1. Với đường chuẩn ở dạng y =ax+b, hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính theo công thức sau:

Trong đó:

- C là nồng độ từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu, tính theo mg/kg.

- Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào GC, tính theo đơn vị diện tích.

- a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.2.1.

- F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích phân đoạn dịch chiết thu được sau khi làm sạch (5.4.2.3) và khối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng.

____________________________________